脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗的主要目的是測量消毒劑滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus、PV)所需的劑量，以驗證病毒污染物消毒的實際劑量。內(nèi)蒙環(huán)保管家對脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗的試驗原理是用細胞感染法測量消毒劑作用前后(或?qū)嶒灲M和對照組)樣本中脊髓灰質(zhì)炎的量，以細胞病變?yōu)榕袛嘀笜?，確定每組病毒的感染滴度，計算消毒劑對脊髓灰質(zhì)炎的滅活率。

　　脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗分組。

　　1)測試組。根據(jù)被測消毒劑對其他微生物的殺滅或滅活劑量的估計，設(shè)置合適的濃度和作用時間組（不少于1濃度和3作用時間），作用時間的設(shè)計不得少于30s。

　　2)陽性對照組。用去離子水代替消毒劑，按照試驗組規(guī)定的步驟加入脊髓灰質(zhì)炎懸液進行試驗培養(yǎng)，觀察脊髓灰質(zhì)炎生長是否良好。

　　3)陰性對照組。以不含脊髓灰質(zhì)炎的完全培養(yǎng)基作為陰性對比，觀察所用培養(yǎng)基是否污染，細胞是否生長良好。

　　脊髓灰質(zhì)炎懸液定量滅活試驗的操作程序。

　　1)從液氮中取出冷凍試驗宿主細胞，在37℃溫水中迅速融化，用細胞維持液洗滌兩次后，轉(zhuǎn)移到10毫升完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中。逐日觀察細胞生長情況，用于消毒試驗。

　　2)取出低溫冷凍脊髓灰質(zhì)炎-1毒株，37℃水浴融化，用細胞維持液稀釋10倍，然后接種到含有單層細胞的細胞瓶中，放入37℃溫箱中，與細胞吸附生長。每天觀察病變，當(dāng)3/4細胞發(fā)生病變時，收獲病毒。收獲時，取出培養(yǎng)液，用超聲波或反復(fù)凍融破碎宿主細胞，盡快離心，將含病毒的上清液按每管1.Oml分裝在無菌離心管(1.5ml)中，冷凍保存在-80℃?zhèn)溆谩?/span>

　　3)取待測消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的1.25倍，備用于20℃±1℃水浴。

　　4)取100μ1有機干擾物與100μ1病毒原液混合，在20℃+1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待檢消毒劑，立即混合并記。在規(guī)定的時間內(nèi)，立即取出0.1ml，加入中和劑混合；或采用合格的除藥方法。

　　5)在陽性(病毒)對照組試驗中，用無菌去離子水代替消毒劑。

　　6)每組分別測量病毒滴度，可采用終點稀釋法或噬斑法。

　　7)試驗重復(fù)三次。

　　8)終點稀釋法的操作步驟:首先用細胞維持培養(yǎng)液對滴定樣本進行10倍系列稀釋，然后在96孔培養(yǎng)板上滴定每個稀釋樣本中殘留的病毒量，每個稀釋度為4孔(每個孔應(yīng)長滿單層宿主細胞)，37℃放置1h~2h，確保殘留病毒全部吸附在細胞上。取出培養(yǎng)板，更換細胞維持培養(yǎng)液。繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃，5%CO)，在顯微鏡下逐日觀察細胞病變，連續(xù)觀察3d，逐孔觀察記錄細胞病變。終點稀釋病毒感染滴度的計算:表示半數(shù)細胞感染劑量。

　　9)噬斑法的操作步驟:首先用細胞維持培養(yǎng)液稀釋滴定樣本10倍，然后接種到細胞培養(yǎng)瓶中，滴定每個稀釋樣本中殘留的病毒量。在接種細胞之前，將生長致密的單層細胞中的培養(yǎng)液傾出，加入1ml待測樣品，放置37℃吸符1h~2h，傾出樣液，加入含有0.8%瓊脂的細胞維持液3m1，冷卻后翻轉(zhuǎn)細胞瓶，放置37℃培養(yǎng)48h~72h。然后每瓶細胞加入2m1甲醛溶液固定幾分鐘，用自來水沖洗，用結(jié)晶紫溶液染色幾分鐘，沖洗后計數(shù)。細胞瓶內(nèi)圓形不著色的透明區(qū)域為蝕斑單位，計算每毫升樣品中的病毒含量:pfu/m1=平板平均蝕斑×稀釋倍數(shù)。為便于計數(shù)，病毒蝕斑一般控制在每個細胞瓶10pfu~30pfu。

　　計算脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗。

　　滅活對平均值按以下類型計算陽性(病毒)對照組平均病毒感染滴度為No，實驗(消毒)組平均病毒感染滴度為Nx。

　　平均滅活值=logNo-logNx。

　　脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗的評價規(guī)定。

　　1)脊灰病毒滅活試驗可用于評估器械、餐具、物體表面和皮膚用化學(xué)消毒劑對病毒的滅活效果。病毒滅活滴度應(yīng)達到4個對數(shù)值。

　　2)正常情況下，3次試驗的平均滅活對值≥4.00，可判定為對脊髓灰質(zhì)炎病毒污染物進行消毒的實驗室試驗。同時，陽性對照組病毒滴度對數(shù)值應(yīng)在5~7之間。

　　脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗注意事項。

　　1)操作人員應(yīng)具備基本的病毒學(xué)實驗經(jīng)驗，盡量使用移液器和無菌一次性吸頭。

　　2)在殺菌試驗中，每次應(yīng)設(shè)置陽性對照。

　　3)使用病毒載體進行試驗的，可參照上述懸液定量試驗程序，并按照病毒學(xué)原理進行適當(dāng)修改。

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